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June 15, 2020
Os diagnósticos baseados no cfDNA podiam fazer a biópsia do tecido obsoleta
Biópsias caras e invasoras do tecido para detectar a rejeção do allograft após a transplantação para ter limitações numerosas. Os ensaios baseados em ADN sem célula (cfDNA) — fragmentos de circulação do ADN liberaram-se das pilhas, tecidos, e os órgãos como se submetem à pilha natural morte-têm sido estudados intensivamente recentemente e poderiam finalmente melhorar nossa capacidade para detectar a rejeção, o implementar muda mais cedo na gestão, e aumenta mesmo a sobrevivência a longo prazo de órgãos transplantados.
Os ensaios de CfDNA que contornam a necessidade para o inteiro-genoma que arranja em sequência (WGS) e a necessidade para o conhecimento a priori dos genótipo fornecedores e/ou destinatários têm vantagens logísticas poderosas e estão atualmente sob o exame minucioso clínico. Além, melhorar o conhecimento da cinética órgão-específica da transplantação de seguimento doador-derivada do cfDNA (dd-cfDNA) igualmente ajudou a aperfeiçoar estes ensaios. Os laboratórios igualmente introduziram métodos alternativos para determinar o dd-cfDNA, tal como a reação em cadeia digital (PCR) da polimerase da gota e testes padrões órgão-específicos do methylation do ADN. Como tal, o campo dos diagnósticos minimamente invasores baseados no cfDNA é biópsias tradicionais potencialmente de substituição cada vez mais prometedoras, de um dia do tecido.
O PAPEL DE CFDNA NA REJEÇÃO DO ÓRGÃO
A rejeção, referindo ferimento de um órgão doado causado pelo sistema imunitário do receptor, pode causar a deficiência orgânica do allograft e mesmo a morte paciente. A rejeção celular aguda negociada t-cell (ACR) ocorre o mais frequentemente dentro dos primeiros 6 meses da cargo-transplantação (1). O ACR envolve a acumulação de T-pilhas de CD4+ e de CD8+ no espaço intersticial do allograft enquanto o sistema imunitário do receptor reconhece antígenos no órgão doado como estrangeiro. Estas T-pilhas iniciam uma cascata imune que conduza finalmente à morte celular programada (apoptosis) das pilhas visadas. Enquanto estas pilhas morrem, o ADN genomic está fendido e os fragmentos do dd-cfDNA, medindo aproximadamente 140 pares baixos (bp) de comprimento, são liberados para juntar-se à associação do cfDNA destinatário no sangue e excretados finalmente na urina (2).
O cfDNA de circulação recentemente leveraged como uma ferramenta diagnóstica para substituir biópsias invasoras em outras áreas da medicina, incluindo analisando fragmentos fetal do ADN dentro da circulação materna para identificar dentro anomalias genéticas - utero e arranjando em sequência o ADN de circulação liberado das pilhas do tumor para identificar mutações câncer-relacionadas. Em ambos estes casos assim como na transplantação, arranjar em sequência da alto-taxa de transferência que identifica e determina diferenças da sequência do ADN distingue entre as duas populações diferentes do cfDNA derivadas das fontes distintas (2). Três características do cfDNA fazem-lhe um biomarker não invasor excelente do candidato para detectar a rejeção após a transplantação contínua do órgão: Pode ser obtida de uma tração simples do sangue, de sua concentração medida exatamente, e de sua sequência de nucleotide identificada facilmente. Usar o cfDNA como um biomarker para o ACR é igualmente vantajosa desde que é derivada das pilhas feridas do órgão doado e deve consequentemente representar uma medida direta da morte celular que ocorre no allograft. Além disso, o cfDNA mantém todas as características genéticas do ADN genomic original, permitindo o material genético liberado do órgão doado a ser diferenciado do cfDNA derivado das pilhas do receptor que se estão submetendo ao apoptosis natural (3).
A monitoração frequente e exata da saúde do allograft é essencial para a sobrevivência a longo prazo dos receptores da transplantação. Para a transplantação (HT) do coração, a biópsia endomyocardial (EMB) é a bandeira de ouro atual para detectar ACR (4). Contudo, EMBs é caro com limitações significativas, muitas de que seja comum a todas as biópsias do órgão (5-7). Além disso, a natureza invasora de EMBs põe pacientes do GH em risco das complicações (6,8,9).
Infelizmente, atualmente métodos não invasores disponíveis que incluem a ecocardiografia ou especificidade da falta de (MRI) da ressonância magnética a suficiente e sensibilidade para detectar confiantemente a rejeção (10-13). os biomarkers Sangue-baseados, tais como o cfDNA, representam uma alternativa prometedora que poderia prontamente ser executada na prática clínica (14-17).
CINÉTICA DE CFDNA DURANTE A TRANQUILIDADE E A REJEÇÃO
Desde que o cfDNA origina do processo natural de apoptosis, todos os indivíduos têm níveis detectáveis de cfDNA em seu sangue (18). Para indivíduos saudáveis, a maioria do cfDNA de circulação vem das pilhas hematopoietic que se submeteram à morte natural relativa ao retorno celular. Os níveis de cfDNA flutuam para as razões múltiplas que incluem a infecção, a cirurgia, o traumatismo, ou mesmo o exercício exaustivo (2,19). Consequentemente, desenvolver um ensaio cfDNA-baseado para detectar a rejeção exige a avaliação da cinética prevista da liberação dd-cfDNA na cargo-transplantação da circulação do receptor. Esta consideração é especialmente importante desde que a liberação ao longo do tempo da cargo-transplantação dd-cfDNA é órgão-específica (20-22).
Por exemplo, em 1 cargo-GH do dia o nível médio de dd-cfDNA é 3,8 o ± 2,3% (20). Contudo, em 7 dias o nível de dd-cfDNA diminuiu rapidamente e permanece consistentemente baixo (<1>
ao contrário, os receptores de transplantações bilaterais do pulmão foram encontrados para ter uma fração dd-cfDNA média 26 do ± 14% no primeiro dia pós-operatório. Além disso, a redução no dd-cfDNA foi caracterizada pelos níveis de dd-cfDNA que diminuíram rapidamente dentro da primeira semana mas por outro lado retardada e permanecida geralmente em 1%-3% (21). Contudo, similar às transplantações do coração e do rim durante um episódio da rejeção aguda, o nível de dd-cfDNA aumentou significativamente, escalando a uma média de 14%-15%.
As diferenças na massa de tecido e nas taxas de retorno celular esclarecem esta variabilidade nos níveis de cargo-transplantação adiantada liberada dd-cfDNA e durante a tranquilidade. Por exemplo, as diferenças em circular os níveis dd-cfDNA em transplantações quietas bilaterais e do único-pulmão podem ser explicadas pela diferença no retorno celular, sendo 107 contra 58 pilhas/em segundo, respectivamente (21). Pelo contraste, em um coração transplantado quieto, a taxa de retorno celular é somente 8 pilhas/em segundo (21-23). Assim, uma compreensão dos níveis previstos de dd-cfDNA associados com um órgão contínuo dado é essencial facilitar o desenvolvimento dos ensaios órgão-específicos que detectam a rejeção. Uma vez que as cinéticas da liberação do cfDNA para um órgão particular são compreendidas, diversos métodos existem determinando a quantidade relativa de dd-cfDNA.
ESTRATÉGIAS PARA DISTINGUIR O RECEPTOR CONTRA DONOR-DERIVED CFDNA
Sexo-má combinação do Doador-receptor
Para as transplantações de órgão em que o doador é masculino e o receptor é fêmea, os laboratórios podem leverage esta má combinação do sexo para calcular os níveis dd-cfDNA de dentro da associação total do cfDNA do receptor (17). Os pesquisadores demonstraram primeiramente a possibilidade desta aproximação nas amostras de urina tomadas dos receptores renais fêmeas da transplantação que tinham recebido um rim dos doadores masculinos e quando experimentaram níveis elevados demonstrados rejeção de dd-cfDNA em sua urina que conteve especificamente as regiões encontradas no cromossoma de Y (17). Embora esta aproximação permita o diagnóstico seguro da rejeção no allograft, a sexo-má combinação entre o doador e o receptor é relativamente rara e não universalmente aplicável.
Diferenças da sequência do ADN do Doador-receptor
Uma transplantação de órgão pode igualmente ser considerada como uma transplantação do genoma, porque as pilhas dentro de um órgão transplantado contêm a informação genética de seu doador. Como tal, o conceito da dinâmica (GTD) da transplantação do genoma confia na presença de diferenças genéticas entre o doador e o receptor em um locus particular, que então possa ser leveraged para identificar a origem do cfDNA de circulação (20-24). Idealmente, o receptor seria homozygous para uma única base (por exemplo, AA) e no mesmo locus o doador seria homozygous para uma base diferente (por exemplo, GG).
Dado a heterogeneidade genética entre indivíduos, os dez dos milhares de locus potencialmente informativos através do genoma podem ser interrogados usando a alto-taxa de transferência que arranja em sequência para distinguir o dd-cfDNA do cfDNA destinatário (20,24). Este conceito foi ilustrado primeiramente usando amostras depositadas dos doadores cardíacos para obter genótipo fornecedores a priori para cada emparelhamento do doador-receptor. Após ter extraído e ter arranjado em sequência o cfDNA de cada receptor, a fração de moléculas doador-específicas era determinada. Nas amostras tomadas durante ou imediatamente antes de um evento biópsia-provado da rejeção, a proporção de únicos polimorfismos doador-específicos (SNPs) do nucleotide foi encontrada para ter aumentado <1>de 3%-4% (24).
Este estudo retrospectivo adiantado foi validado agora em perspectiva. Os receptores adultos e pediatras da transplantação do coração e do pulmão foram recrutados e os genótipo para cada par do doador-receptor foram obtidos através do WGS com uma média de 53.423 marcadores informativos de SNP identificados (20). Total, a detecção atempada de rejeção aguda era superior àquela de AlloMap, o primeiro alimento e droga aproximação não invasora Administração-aprovada a detectar o ACR após o GH baseado na análise do transcriptome (25).
A pesquisa igualmente mostrou que o WGS fornece não somente a informação sobre um enxerto mas igualmente o virome de um paciente e o estado total de immunosuppression. Isto representa uma vantagem potencialmente grande não obtenível por outros ensaios (26-28).
Contudo, o WGS enfrenta os desafios que poderiam impedir que esteja executado rotineiramente na prática clínica. Por exemplo, quando a informação genética de um receptor puder facilmente ser obtida, isto não é sempre verdadeiro para um doador. Além disso, o WGS é caro, trabalho - intensivos, e demorados.
Um método alternativo emprega um painel de SNPs polimorfo genotyped identificado dentro da associação do cfDNA extraído que elimina desse modo a necessidade para o conhecimento a priori do genótipo específico de um doador (29). Ao contrário das transplantações do rim e do fígado, que ocorrem frequentemente entre indivíduos estreitamente relacionados, os pares do doador-receptor para o coração e as transplantações do pulmão não são tipicamente relacionados. GTD exige genotyping do receptor e do doador da transplantação. Contudo, na prática, a informação fornecedora do genótipo é frequentemente não disponível. Aqui, nós endereçamos esta edição desenvolvendo um algoritmo que calcule os níveis dd-cfDNA na ausência de um genótipo fornecedor. Nosso algoritmo prevê a rejeção do allograft do coração e do pulmão com uma precisão que seja similar a GTD convencional. Nós além disso refinamos o algoritmo para tratar receptores e doadores estreitamente relacionados, uma encenação que fosse comum na transplantação de medula e de rim. Nós mostramos que é possível calcular o dd-cfDNA nos doentes transplantados da medula que são não relacionados ou que são irmãos dos doadores, usando um modelo escondido de Markov. Consequentemente, os algoritmos foram desenvolvidos para as transplantações do coração e do pulmão que supõem que o genótipo do doador ocorre na mesma frequência que a população geral. Baseado nestas frequências e em comparação ao genótipo conhecido do receptor, a fração do dd-cfDNA pode confiantemente ser calculada da associação total do cfDNA isolada da amostra do plasma de um receptor.
No caso da transplantação do pulmão, este modelo do único-genoma, quando comparado à metodologia usando os genótipo fornecedores e destinatários, foi encontrado para fornecer frações comparáveis do dd-cfDNA. Contudo, quando os pesquisadores aplicaram este mesmo algoritmo ao GH, os níveis calculados de dd-cfDNA não foram correlacionados tão fortemente quanto em transplantações do pulmão. Isto pôde ser relacionado às quantidades absolutas mais baixas de dd-cfDNA atuais após o GH. Este é um outro exemplo da cinética órgão-específica do cfDNA que pode influenciar resultados do ensaio e deve ser tomada em consideração (30).
No caso da transplantação renal, os estudos em perspectiva foram conduzidos para verificar a utilidade dos níveis dd-cfDNA, identificada usando SNPs doador-específico conhecido, como um marcador viável para a rejeção. Em um tal estudo, 384 receptores do rim foram recrutados de 14 locais clínicos para fornecer amostras de sangue em intervalos programados e na época das biópsias clinicamente indicadas (31). Total, o estudo centrou-se sobre a correlação entre a histologia em 107 espécimes da biópsia de 102 pacientes e os níveis de dd-cfDNA encontrados em amostras combinadas do plasma. Mais especificamente, 27 amostras da biópsia de 27 pacientes com rejeção ativa foram obtidas junto com 80 amostras da biópsia de 75 pacientes sem rejeção ativa.
Neste estudo, a rejeção ativa incluiu a rejeção anticorpo-negociada aguda (AMR), Amr crônico, e ACR. O ensaio usado neste estudo empregou uma interrupção de 1% para a fração do dd-cfDNA para indicar a presença ou a ausência de rejeção ativa e foi encontrado para ter a especificidade de 85% (CI de 95%, 79%-91%) e a sensibilidade de 59% (CI de 95%, 44%-74%). A sensibilidade deste ensaio era maior para discriminar entre o Amr ativo e ausente, porque o uso de uma interrupção do dd-cfDNA de 1% foi encontrado para ter uma especificidade de 83% (CI de 95%, 78%-89%) e a sensibilidade de 81% (CI de 95%, 67%-100%). Notavelmente, em ambos os casos, a sensibilidade diminuiu substancialmente quando a fração do dd-cfDNA excedeu 3%.
Para melhorar a especificidade e a sensibilidade de um ensaio cfDNA-baseado não invasor para detectar a rejeção seguir a transplantação renal, os investigador igualmente examinaram a quantidade absoluta de dd-cfDNA (32-33). Interrogando a quantidade absoluta de dd-cfDNA, um pode eliminar as mudanças artificiais na fração do dd-cfDNA devido aos aumentos nos níveis totais do cfDNA causados por eventos da não-rejeção, tais como a infecção, o traumatismo, ou o exercício, criando potencialmente um ensaio mais exato.
Para investigar esta possibilidade, um estudo empregou 32 variações informativas (CNVs) do número de cópia baseado em frequências da população, ao contrário das proporções relativas de fornecedor e de receptor SNPs nos locus dados (32). Todo o CNVs não atual dentro do genoma de um receptor mas o presente dentro do cfDNA extraído foi suposto consequentemente para representar o dd-cfDNA.
Interessantemente, quando a especificidade e a sensibilidade melhoraram em geral com o uso dos níveis dd-cfDNA absolutos, este ensaio igualmente teve uma capacidade maior distinguir entre a presença e a ausência de Amr ativo, ao contrário dos exemplos do ACR ativo. Além, os níveis da creatinina do soro não eram suficientes na discriminação entre a rejeção ativa e a tranquilidade, prováveis porque é mais indicativa da função glomerular ao contrário de dano de tecido do rim (31-33).
Um outro estudo explorou os níveis absolutos de dd-cfDNA nos receptores da transplantação do rim relativos aos níveis de tacrolimus, um imunossupressor (33). Aqui, os pesquisadores encontraram que a quantidade absoluta de dd-cfDNA era substancialmente mais alta nos pacientes com mais baixo tacrolimus nivela (<8>
os laboratórios igualmente propuseram alternativas ao WGS. Nosso arranjar em sequência visado explorado grupo de 124 (frequência menor do alelo [MAF] >0.4) SNPs altamente polimorfo usando um painel disponível no comércio, a próxima geração que arranjam em sequência, e um algoritmo novo (34). Esta aproximação reduziu significativamente a quantidade total de arranjar em sequência custos e o tempo exigido, de diminuição do ensaio, e a possibilidade da análise rápida. Contudo, desde que este ensaio confia em diferenças em MAF entre indivíduos, não seria robusta para pares estreitamente relacionados do doador-receptor, tais como visto em doação viver-relacionada do rim. Permanece ser validada detectando eventos moderados ou maiores da rejeção.
Os laboratórios igualmente exploraram usando SNPs polimorfo para determinar o dd-cfDNA combinado com a tecnologia de PCR digital da gota (30,35-37). Usando 41 SNPs altamente polimorfo, o rim estável e os receptores do GH mostraram as frações dd-cfDNA de 2%-3% com os receptores estáveis da transplantação do fígado que têm um nível de 7% (35).
CONCLUSÕES
O uso de uma biópsia cara e invasora do tecido detectar a rejeção do allograft tem limitações significativas. Como tal, um ensaio minimamente invasor que possa diretamente e exatamente avaliar a saúde do órgão transplantado inteiro representa um Santo Graal na transplantação contínua do órgão.
O uso do cfDNA depois que a transplantação mostrou alguma promessa inicial, mas estuda mais e a validação é exigida para melhorar nossa compreensão da biologia básica do cfDNA assim como de sua cargo-transplantação do comportamento. Neste tempo, é claro que as diferenças órgão-específicas importantes existem, e os testes padrões da liberação do cfDNA podem igualmente diferir segundo o tipo de evento da rejeção. Contudo, o cfDNA representa um das tecnologias as mais prometedoras contudo desenvolvido para complementar ou mesmo substituir finalmente a biópsia do tecido.
